Baden-Württemberg

Die Untersuchungsämter für Lebensmittelüberwachung und Tiergesundheit

Neue Analysenmethoden gegen Lebensmittelbetrug und Täuschung startklar

Julia Maier, Marc Ohmenhäuser, Vanessa Schilling, Martin Rupp, Hans-Ulrich Waiblinger (jeweils CVUA Freiburg), Jan Teipel, Dr. Sandra Weber, Prof. Dr. Thomas Kuballa, Pascal Hindelang, Andreas Scharinger (jeweils CVUA Karlsruhe)

 

Sind das wirklich Bio-Eier oder stammen sie nicht doch aus konventioneller Erzeugung? Ist der Honig auch wirklich authentisch?

Verbraucherinnen und Verbraucher wollen beim Kauf hochwertiger Lebensmittel auf die Angaben vertrauen können, wie etwa zur Haltungsform oder zur ökologischen Erzeugung von Hühnereiern oder der Qualität bei Honig. Die Überprüfung solcher Fragestellungen hat für die Lebensmittelüberwachung einen hohen Stellenwert. Damit die Lebensmittelkontrolle sich hier nicht allein auf Dokumenten- und Plausibilitätsprüfungen verlassen muss, arbeiten die Chemischen und Veterinäruntersuchungsämter Baden-Württembergs (CVUA BW) bereits seit einigen Jahren an der Etablierung geeigneter Analysenverfahren. Die Neu- und Weiterentwicklung von Untersuchungsverfahren wird vom Ministerium für Ernährung, ländlichen Raum und Verbraucherschutz (MLR BW) gezielt mit Forschungs- und Entwicklungsprojekten gefördert.

 

Abbildung 1 - Abtrennung der Eidotter (links) und Extraktion des Dotterfetts (rechts)

Abbildung 1 - Abtrennung der Eidotter (links) und Extraktion des Dotterfetts (rechts)

 

Eine Analysenmethode mit vielversprechendem Potential, solche Angaben schnell zu überprüfen, ist die NMR-Spektrometrie. Bei der Etablierung dieser Methode in der Praxis konnten die CVUAs Karlsruhe und Freiburg wichtige Etappenziele erreichen:

  • Zum schnellen Screening der Authentizität von Honigen sowie
  • zur Überprüfung der Rechtmäßigkeit der Bio-Angabe bei Eiern

kann nun die NMR-Analytik auch im „Echtbetrieb“ in der Lebensmittelüberwachung eingesetzt werden.

 

Bei der Differenzierung von Eiern (bio /konventionell) handelt es sich um das erste in Deutschland routinemäßig im Rahmen einer EN 17025-Akkreditierung in der Lebensmittelüberwachung eingesetzte non-targeted NMR-Verfahren, eine sogenannte „nicht zielgerichtete Methode“. Die CVUAs bekommen damit eine Möglichkeit, auch Lebensmittelproben zu beurteilen, bei denen nicht bestimmte einzelne Inhaltsstoffe qualitativ/ quantitativ untersucht werden, sondern bei denen ein umfassendes analytisches Profil („Fingerabdruck“) der aktuellen Probe ausgewertet wird.

Kernspinresonanzspektrometrie

Mit der Kernspinresonanzspektrometrie, kurz NMR-Spektrometrie steht am CVUA Karlsruhe eine analytische Technik zur Verfügung, die einen großen Probendurchsatz erlaubt und dabei die simultane Bestimmung vieler beurteilungsrelevanter Parameter ermöglicht. Daher ist die NMR-Analytik für effiziente Screening-Verfahren besonders interessant. Die detailreichen, hochgradig reproduzierbaren und in ihren Intensitäten quantitativen NMR-Spektren sind aussagekräftige „chemische Fingerabdrücke“ der untersuchten Proben und können daher auch zur Authentizitätsprüfung tierischer und pflanzlicher Lebensmittel eingesetzt werden. Eine statistische Auswertung der Fingerabdrücke ermöglicht grundsätzlich Aussagen etwa zur Haltungsform (bio/konventionell) von Hühnern resp. der Eier, zur botanischen Herkunft und Zusammensetzung von Honigen (sog. Trachten), zu Kaffeespezies (ca. 40% teurerer Arabica vs. Canephora) oder zu Tierarten.

 

Generell ist die analytische Überprüfung von Angaben etwa zur Haltungsform oder der ökologischen Erzeugung eine große Herausforderung. Die Analytik beruht zumeist auf sogenannten nicht zielgerichteten Methoden. Bei nicht zielgerichteten Methoden handelt es sich meist um Kombinationen komplexer Analysentechniken mit anschließenden multivariat-statistischen Auswertungen, bei denen nicht nur einzelne Parameter (zielgerichtet) erfasst werden, sondern eine Vielzahl an Daten aus dem chemischen Fingerabdruck der Probe zur Klassifikation ausgewertet werden. Zu prüfende Proben werden mittels statistischer Verfahren mit Referenz-Datenbanken verglichen und bewertet. Die Beurteilung der Ergebnisse erfordert viel Erfahrung und bedarf häufig einer von der jeweiligen Fragestellung abhängigen, spezifischen Herangehensweise. Durch die Kombination von Ergebnissen unterschiedlicher analytischer Verfahren werden oft zuverlässigere und aussagefähigere Bewertungen möglich.

Ei, aufgeschlagenEier – bio oder konventionell?

Aufbauend auf Ergebnissen aus früheren Forschungsprojekten haben die CVUAs Karlsruhe und Freiburg gemeinsam ein NMR-Verfahren zur Überprüfung der Rechtmäßigkeit der Bio-Auslobung von Eiern in der Praxis der Lebensmitteluntersuchung etabliert.

 

Für die Analyse werden die Eier am CVUA Freiburg in Eiklar und Eigelb getrennt. Das Eigelb wird homogenisiert, gefriergetrocknet und daraus das Fett mit einem Lösungsmittelgemisch extrahiert. Das Fett wird eingewogen und an das CVUA Karlsruhe für die 1H-NMR-Messung versendet. Die anschließende Datenauswertung der Spektren sowie die Differenzierung der Haltungsformen „Bio“ oder „Konventionell“ erfolgt mittels eines in der Software MATLAB® programmierten Skriptes (Ergebnis siehe Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Grundlage für das Verfahren, also die Datenbank, auf der die Auswertung beruht, wird fortlaufend aktualisiert, um beispielsweise Trends in der Legehennen-Haltung erfassen zu können.

Abbildung 2 - Konfusionsmatrix (li.) und Score Plot aller das Modell aufbauenden Ei-Proben (Stand März 2022) mit den Ellipsoiden der 95%-Konfidenzintervalle. Die Konfusionsmatrix zeigt, dass vom Auswertealgorithmus nur etwa 6% der Bio-Eier falsch negativ, also auffällig klassifiziert werden.

Abbildung 2 - Konfusionsmatrix (li.) und Score Plot aller das Modell aufbauenden Ei-Proben (Stand März 2022) mit den Ellipsoiden der 95%-Konfidenzintervalle. Die Konfusionsmatrix zeigt, dass vom Auswertealgorithmus nur etwa 6% der Bio-Eier falsch negativ, also auffällig klassifiziert werden.

Abbildung 3 - Grafische Darstellung der Auswertung von Eiern einer Messreihe (Abkürzungen: B = bio, F = Freiland, G = Bodenhaltung, R-Ei =  Kontrollprobe). Alle als „bio“ ausgelobten Proben liegen im richtigen Erwartungsraum (grünes Ellipsoid), sind also unauffällig, ebenso die konventionell erzeugten Eier. Das Diagramm zeigt die ersten drei Dimensionen (PC1 bis 3) einer Hauptkomponentenanalyse und die 95%-Konfidenzellipsoide der Referenzdatenbank.

Abbildung 3 - Grafische Darstellung der Auswertung von Eiern einer Messreihe (Abkürzungen: B = bio, F = Freiland, G = Bodenhaltung, R-Ei = Kontrollprobe). Alle als „bio“ ausgelobten Proben liegen im richtigen Erwartungsraum (grünes Ellipsoid), sind also unauffällig, ebenso die konventionell erzeugten Eier. Das Diagramm zeigt die ersten drei Dimensionen (PC1 bis 3) einer Hauptkomponentenanalyse und die 95%-Konfidenzellipsoide der Referenzdatenbank.

 

Das Prüfverfahren wurde in enger Zusammenarbeit der beiden Häuser umfangreich validiert. Hierfür wurden unter anderem Mischungsversuche mit Eiern aus konventioneller und ökologischer Erzeugung ausgewertet sowie Eier aus dem selben Betrieb, aber mit unterschiedlichen Legedaten analysiert. Darüber hinaus wurde eine mittels MATLAB® vollautomatisierte Qualitätskontrollkarte entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Methode zu überwachen (siehe Abbildung 4).

 

Abbildung 4 – 1H-NMR Spektrum der Reproduzierbarkeits-Eiprobe. Markiert sind vier für die Regelkarte zur Prozessüberwachung ausgewählte Signale. Das gesamte Spektrum ist typisch für die unterschiedlichen Inhaltsstoffe des Eifetts (z. B. Phospholipide, Triglyceride)

Abbildung 4 – 1H-NMR Spektrum der Reproduzierbarkeits-Eiprobe. Markiert sind vier für die Regelkarte zur Prozessüberwachung ausgewählte Signale. Das gesamte Spektrum ist typisch für die unterschiedlichen Inhaltsstoffe des Eifetts (z. B. Phospholipide, Triglyceride).

 

Mit jeder Messreihe wird ein Aliquot aus einem größeren Vorrat homogenisierten Reproduzierbarkeits-Eigelb analog zu den Proben präpariert und dann untersucht. Solange die Ergebnisse in engen Toleranzgrenzen gleichbleiben, ist gesichert, dass sich kein systematischer Fehler in die Aufarbeitung und Messung eingeschlichen hat.

 

Neben der 1H-NMR stehen dem CVUA Freiburg zudem die visuelle Prüfung der Eidotterfarbe sowie die Carotinoidanalytik mittels HPLC zur Verfügung, um Verfälschungen bei Bio-Eiern auf die Spur zu kommen. Über die Gabe von Carotinoiden im Futter kann eine hellgelbe bis rot-orange Farbe des Eidotters bewirkt werden. In Deutschland weisen konventionelle Eier üblicherweise einen kräftig orange gefärbten Eidotter auf. Erreicht wird dies in der Regel durch den Zusatz synthetischer Carotinoide zum Futter der Legehennen. Für die ökologische Legehennen-Haltung sind diese Futtermittelzusatzstoffe nicht zulässig. Demzufolge weisen Bio-Eier in der Regel hellere (gelbe) Dotter auf. Die visuelle Beurteilung des Eidotters ermöglicht so Hinweise auf die Haltungsart der Legehennen. Mit Hilfe der Carotinoidanalytik können dann die synthetischen Carotinoide im Eidotter identifiziert werden.

Honig im GlasHonig – schnelles Screening auf viele Untersuchungsparameter

Honig ist seit Jahren in der weltweiten „Top 10“ der am häufigsten verfälschten Lebensmittel. Aus diesem Grund besteht die Notwendigkeit, laufend neue analytische Verfahren zu entwickeln, welche zur zuverlässigen Unterscheidung von authentischen und verfälschten Honigen geeignet sind. Institutionen der Lebensmittelüberwachung setzen für diesen Zweck eine Vielzahl etablierter analytischer Verfahren ein. Die analytische Authentizitäts- und Qualitätsprüfung von Honigen erfolgt unter anderem durch die Quantifizierung (s. Abbildung 5) der in Honigproben enthaltenen Substanzen (z. B. Zucker, organische Säuren sowie weitere Qualitätsparameter wie Ethanol oder Erhitzungsindikatoren wie Hydroxymethylfurfural (HMF)) und durch den Abgleich mit authentischen Referenzproben.

Abbildung 5 - Quantitative Auswertung eines Signals von Glucose im Honig-NMR-Spektrum. Die Auswertung mit Kurvenanpassung ermöglicht auch die korrekte Auswertung bei teilweise überlagerten Signalen. Schwarz: NMR-Spektrum der Probe, grün: angepasster Fit des „bereinigten“ Signals, rot: Restfehler, die vom Fit minimierten, nicht erfassten Anteile.

Abbildung 5 - Quantitative Auswertung eines Signals von Glucose im Honig-NMR-Spektrum. Die Auswertung mit Kurvenanpassung ermöglicht auch die korrekte Auswertung bei teilweise überlagerten Signalen. Schwarz: NMR-Spektrum der Probe, grün: angepasster Fit des „bereinigten“ Signals, rot: Restfehler, die vom Fit minimierten, nicht erfassten Anteile.

 

Um Verfälschungen von Honigen auf dem globalen Markt aufdecken zu können, haben das CVUA Freiburg und Karlsruhe in dem gemeinsamen Projekt „Food Fraud“ ein analytisches Verfahren zum Screening von Honigproben unter Verwendung der Kernspinresonanzspektrometrie (NMR) erarbeitet und validiert. Im Rahmen dieses Projekts werden Proben vom Honigzentrallabor des CVUA Freiburg an das NMR-Labor des CVUA Karlsruhe zur Quantifizierung der Inhaltsstoffe übergeben. Am CVUA Karlsruhe erfolgt anschließend die Aufarbeitung der Honigproben und das NMR-Screening. Mithilfe dieses Screeningverfahrens können viele unterschiedliche Parameter quantitativ erfasst werden, die Aufschluss über die Zusammensetzung verschiedener Honigsorten liefern können, wodurch eine erste aussagekräftige Charakterisierung des Honigs möglich ist.

 

Abbildung 6 zeigt einen Quantilplot mehrerer Spektren authentischer Honige, denen das Spektrum eines (mutmaßlich) durch Zugabe von günstigem Zuckersirup verfälschten Honigs überlagert wurde. Der Abgleich zeigt systematische Unterschiede zwischen dem verfälschten Honig und den authentischen Referenzproben. Die unterschiedlichen Signalintensitäten in den Spektren beruhen auf verschiedenen Zuckerkonzentrationen durch den Zusatz von Sirup. Diese abweichenden Konzentrationen stehen im Widerspruch zur Deklaration als Honig.

 

Abbildung 6 - Einzelne, vermutlich durch Zuckerzusatz verfälschte Honigprobe (schwarzes Spektrum) im Vergleich mit dem Quantilplot einer größeren Anzahl von Referenzhonigen (das farbige Band zeigt die übliche, akzeptable Streuung der Signale an.). Auffällige Abweichungen der Einzelprobe deuten auf Menge und Art der Verfälschung hin. (Vereinfachte Darstellung)

Abbildung 6 - Einzelne, vermutlich durch Zuckerzusatz verfälschte Honigprobe (schwarzes Spektrum) im Vergleich mit dem Quantilplot einer größeren Anzahl von Referenzhonigen (das farbige Band zeigt die übliche, akzeptable Streuung der Signale an.). Auffällige Abweichungen der Einzelprobe deuten auf Menge und Art der Verfälschung hin. (Vereinfachte Darstellung)

 

So kann durch den Einsatz der NMR-Spektrometrie ein hoher Probendurchsatz in kurzer Zeit ressourcenschonend erzielt werden. Zur Absicherung der Screening-Ergebnisse werden auffällige Proben mit etablierten Referenzmethoden der Honiganalytik überprüft.

 

Aktuell wird darüber hinaus am Nationalen Referenzzentrum für Lebensmittelauthentizität beim Max-Rubner-Institut in bundesweiter Zusammenarbeit eine Referenzdatenbank aufgebaut. Mit dieser soll zukünftig anhand der Auswertung von NMR-Spektren die Authentizität der Honigtracht verifiziert werden. Es handelt sich dabei um ein „non-targeted“ Verfahren, welches das NMR-Spektrum als chemischen Fingerabdruck des Honigs multivariat-statistisch auswertet. Die Grundlagen für dieses Verfahren wurden im Rahmen früherer Forschungsprojekte an den CVUAs Freiburg und Karlsruhe erarbeitet.

 

 

Weitere Informationen

CVUAs Baden-Württemberg (2020) Neue Analysenmethoden gegen Lebensmittelbetrug und Täuschung

 

 

Bildnachweis

CVUA Freiburg und Karlsruhe

 

 

 

Artikel erstmals erschienen am 21.04.2022 09:01:16

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