Über unsErregeridentifizierung: Infrarotspektroskopie
Die mikrobiologische Untersuchung von Proben bei lebensmittelbedingten Humanerkrankungen oder auch Tierkrankheiten hat mehrere wichtige Ziele:
Die Identifizierung des Erregers bis hinunter auf die Ebene der Art. Diese Aufgabe gelingt oft durch eine Kombination aus klassischer mikrobiologischer Untersuchung und der MALDI-TOF MS.
Bei einigen Erregern werden zusätzlich Pathogenitätsfaktoren ermittelt oder Sero- und Biotypen unterschieden. Auch die Aufklärung der Infektionsquelle erfordert eine deutlich feinere Untersuchung. Hierbei muss der Nachweis geführt werden, ob Isolate der gleichen Art aber unterschiedlicher Herkunft (z.B. aus Lebensmittel und Patient oder aus Milch und Stalltupfer-Probe) miteinander in Zusammenhang stehen. Für diese Aufgaben wird am CVUA Stuttgart die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) eingesetzt.
Das Messprinzip: Die FT-IR bildet die Gesamtheit der biochemischen Zusammensetzung der Mikroorganismen ab. Durch Infrarot-Strahlung (Wärmestrahlung) werden Moleküle zu Bewegungen (Schwingungen, Rotationen) angeregt. Bestimmte Bindungen in chemischen funktionellen Gruppen nehmen dabei Strahlung definierter Energie auf. Die Absorptionen der molekularen Bindungen in Molekülen wie Fetten, Proteinen oder Ribonukleinsäuren bei unterschiedlichen Wellenlängen des infraroten Lichtes führen zu einem charakteristischen Gesamtspektrum, das den aktuellen stofflichen Status bzw. den Phänotyp der Zellen wiedergibt. Durch Standardisierung der Anzuchtbedingungen können für die Isolate reproduzierbare Spektren erzeugt werden, die - einem Fingerabdruck gleich - ein typisches Muster für dieses Isolat darstellen. Die Technik zeigt zum Teil mit Hilfe Künstlicher Neuronaler Netze eine sehr gute Auflösung in taxonomischen Bereichen weit unter der Speziesebene. Die FT-IR besticht zudem durch ihren einfachen Arbeitsablauf und ihre hohe Geschwindigkeit bei gleichzeitig geringen Verbrauchskosten.
Ermutigt durch die für uns wichtigen Arbeiten am Robert-Koch-Institut Berlin [u.a. Naumann et al, 1991) und an der Technischen Universität München [u.a. Oberreuter et al., 2002] setzt das CVUA Stuttgart die FT-IR in der Mikrobiologie seit 2003 ein. Zeitweilig durch das zuständige Ministerium für Ländlichen Raum und Verbraucherschutz unterstützt konnte die FT-IR mit eigens entwickelten neuen Methoden weiter entwickelt werden. Dadurch sind nun verschiedene Feindifferenzierungen von Bakterien und eine sehr schnelle Untersuchung auf die Identität bakterieller Isolate für die Aufklärung von epidemiologischen Zusammenhängen möglich. Unsere Ergebnisse veröffentlichen wir regelmäßig.
Einsatzgebiete der FT-IR am CVUA Stuttgart (Beispiele)
- Typisierung von Mikroorganismen
- Nähere Zuordnung von Vertretern der Bacillus cereus Gruppe (Rau et al., 2009)
- Biotypisierung von Yersinia ruckeri, dem Erreger der Rotmaulseuche (Wortberg et al., 2012)
- Typisierung (Biotyp, Serotyp, ail-Faktor) von Yersinia enterocolitica (Kuhm et al., 2009; Stamm et al., 2013)
- Unterscheidung von Impf- und Wildstämmen bei Salmonella (Mauder et al., 2014)
- Unterscheidung von Serogruppen bei Salmonella (Oberreuter & Rau, 2015)
- Oberreuter H. & Rau, J. (2019) Artificial neural network-assisted Fourier transform infrared spectroscopy for differentiation of Salmonella serogroups and its application on epidemiological tracing of Salmonella Bovismorbificans outbreak isolates from fresh sprouts. FEMS Microbiology Letters, 366; fnz193, doi: 10.1093/femsle/fnz193. Advance Access Publication Date: 13 September 2019
- Validated differentiation of Listeria monocytogenes serogroups by FTIR spectroscopy using an Artificial Neural Network based classifier in an accredited official food control laboratory (Oberreuter et al., 2023)
- Unterstützung von Beschreibungen neuer Bakterienarten
- Vergleichsstudien
- Ausbruchsanalysen zu lebensmittelbedingten Erkrankungen
- Staphylococcus aureus aus mehreren Speisen bei einer Familienfeier (Johler et al., 2013) bzw. aus Speiseeis (Fetsch et al., 2014)
- Salmonella aus Sprossen
- Oberreuter H. & Rau, J. (2019) Artificial neural network-assisted Fourier transform infrared spectroscopy for differentiation of Salmonella serogroups and its application on epidemiological tracing of Salmonella Bovismorbificans outbreak isolates from fresh sprouts. FEMS Microbiology Letters, 366; fnz193, doi: 10.1093/femsle/fnz193. Advance Access Publication Date: 13 September 2019
- Ausbruchsanalysen / Fallbeschreibungen zu Tierkrankheiten:
- Pasteurella multocida bei Damhirschen, Schweinen und Rindern (Soike et al., 2013)
- Corynebacterium pseudotuberculosis beim Dromedar (Sting et al., 2017)
- Naumann D, Helm D, Labischinski H (1991) Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature, 351: 81-2.
- Oberreuter H, Seiler H, Scherer S (2002) Identification of coryneform bacteria and related taxa by Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy. Int J Syst Evol Microbiol, 52: 91–100.
Abb. 1: Arbeitsgang in der Infrarotspektroskopie:
Reinkulturen der Isolate werden in Wasser suspendiert, auf einen Zinkselenid-Probenträger aufgetragen und getrocknet. Das Infrarotspektrum des Bakterienfilmes wird am FT-IR Spektrometer im Durchlicht (Transmission) aufgenommen. Dieses IR-Spektrum ergibt ein Muster für das Isolat, das wie ein Fingerabdruck für das jeweilige Isolat sehr spezifisch ist. Somit sind Auswertungen für Zuordnungen unterhalb der Speziesebene, wie beispielsweise dem Serotyp oder für die Kontaminationsroutenanalyse möglich.