Listeria monocytogenes in einem Räucherfischbetrieb – MALDI-TOF-MS-Subtyping als neues „Source-Tracking-Tool”

Dr. Elke Müller-Hohe und Dr. Christine Wind

 

Listeria monocytogenes spielt als Zoonoseerreger in der amtlichen Lebensmitteluntersuchung eine wichtige Rolle. Schnelle Nachweismethoden und zuverlässige Identifizierungstechniken sind dabei unerlässlich. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie hat als moderne Analysetechnik in der mikrobiologischen Untersuchung in den letzten Jahren eine weite Verbreitung erfahren. Eine Identifizierung von Mikroorganismenisolaten ist mit dieser Technik innerhalb kürzester Zeit möglich. Am CVUA Freiburg wird über die Identifizierung hinaus der Einsatz der MALDI-TOF-MS als „Source-Tracking-Tool“ im Routinelabor getestet.

 

Infokasten

Abbildung 1: Kolonien von Listeria monocytogenesListeria monocytogenes: Kleine stäbchenförmige Bakterien, die in der Umwelt weit verbreitet sind. Sie sind Verursacher der Listeriose, einer Infektionskrankheit des Menschen, die mit grippeähnlichen Symptomen, aber auch mit schweren gesundheitlichen Schäden einhergehen kann. Listeria monocytogenes kann unter anderem in rohen Lebensmitteln (z.B. Rohmilchprodukten, Rohwürsten, Kräutern), Käse, Brühwurstaufschnitt oder Räucherfisch vorkommen.

 

MALDI-TOF-MS - Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisierung Flugzeitanalyse (engl. time of flight) Massenspektrometrie: Zur Identifizierung von Mikroorganismen werden spezifische Massenprofile von mikrobiellen Proteinen detektiert. Das daraus resultierende Massenspektrum, eine Art mikrobieller „Fingerabdruck“, wird mit einer Datenbank verglichen.

 

PFGE - Puls-Feld-Gelelektrophorese: Mithilfe dieses Verfahrens wird das Erbgut (DNA) eines Mikroorganismus mit Enzymen (Endonukleasen) in Fragmente gespalten. Diese Fragmente werden elektrophoretisch aufgetrennt und erzeugen für den jeweils untersuchten Mikroorganismen-Stamm spezifische Banden im Gel. Somit können Stämme verglichen und einander zugeordnet werden.

 

Im Rahmen der Untersuchung von Planproben wurden am CVUA Freiburg im Jahr 2014 in einem Betrieb, der Salmoniden züchtet und Räucherfische herstellt, Listeria monocytogenes in einem geräucherten Forellenfilet in Keimgehalten >1,0E2 KbE/g nachgewiesen. In weiteren Räucherfischproben des Betriebes waren Listeria monocytogenes in der Anreicherung positiv. Aus diesen Proben wurden Isolate zur näheren Charakterisierung mittels PFGE (Puls-Feld-Gelelektrophorese) an das nationale Referenzlabor (NRL) für Listeria monocytogenes am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) geschickt.

 

Dabei wurde festgestellt, dass die innerhalb des Betriebes isolierten Listeria monocytogenes-Stämme zwei unterschiedlichen PFGE-Typen zugeordnet werden konnten. In der Folge wurden regelmäßig weitere Proben aus diesem Betrieb amtlich überprüft. Zwei Jahre später, im Jahr 2016, waren in einer Forelle sowie in Umgebungsproben des Betriebes erneut Listeria monocytogenes in der Anreicherung nachweisbar. Um zu überprüfen, ob es sich bei den Listeria monocytogenes-Isolaten aus 2016 um die gleichen Stämme handelte wie 2014, wurden zwei Isolate aus 2014 (ein Isolat je PFGE-Typ) und sechs Isolate aus 2016 mittels MALDI-TOF-MS-Subtyping untersucht.

 

Die Listeria monocytogenes-Isolate wurden mittels MALDI-TOF-MS (MALDI microflex LT/SH System, Bruker) gemessen, die erhaltenen Spektren verglichen und auf kleinste Unterschiede hin analysiert. Übereinstimmende Spektren oder Peakdifferenzen können dabei Hinweise auf gleiche oder verschiedene Stämme liefern (Abbildung 2).

 

Abbildung 2

Ergebnisse und Schlussfolgerungen

Mittels MALDI-TOF-MS-Subtyping konnten die acht untersuchten Isolate in drei Gruppen eingeteilt werden. Die beiden unterschiedlichen Isolate aus 2014 stimmten jeweils mit zwei Isolaten aus 2016 überein. Zwei weitere Isolate aus 2016 zeigten untereinander das gleiche Spektrum, unterschieden sich jedoch von den Isolaten der beiden anderen Gruppen. Zur Überprüfung wurden die Isolate am nationalen Referenzlabor für Listeria monocytogenes mittels PFGE untersucht. Übereinstimmend zu den Subtyping-Ergebnissen wurden die acht Isolate drei unterschiedlichen PFGE-Typen zugeordnet. Somit konnte bei den untersuchten Listeria monocytogenes Isolaten eine Korrelation zwischen MALDI-Typen und PFGE-Typen festgestellt werden.

 

Bei identischen PFGE-Mustern und MALDI-TOF-MS Spektren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um gleiche Stämme handelt. Die Ergebnisse zeigen, dass in dem überprüften Betrieb sowohl in 2014 als auch in 2016 jeweils die zwei gleichen Listeria monocytogenes Stämme nachweisbar waren, was auf eine persistierende Kontamination hinweist. 2016 war darüber hinaus ein weiterer Stamm identifizierbar, der 2014 nicht nachgewiesen wurde. Ggf. kann es sich hierbei um eine neue Kontamination handeln (Abbildung 3).

 

Tabelle 1: Ergebnisse MALDI- TOF-MS-Subtyping & PFGE

Abbildung 3

Zusammenfassung

Durch Einsatz der Subtyping-Technik bietet die MALDI-TOF-Massenspektrometrie die Möglichkeit, Listeria monocytogenes-Isolate auf Stammebene zu unterscheiden. Die Ergebnisse sind innerhalb kurzer Zeit inhouse erzielbar. Das MALDI-TOF-MS-Subtyping kann somit als Screening-Verfahren eingesetzt werden, als Grundlage für betriebliches Monitoring, epidemiologische Studien und sog. „Source-Tracking“.

 

Das Thema MALDI-TOF-MS-Subtyping zur Differenzierung von Mikroorganismen-Stämmen wurde bei der 58. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG vom 26. bis 29. 09. 2017 in Garmisch-Partenkirchen in einem Vortrag und einer Posterpräsentation vorgestellt:

 

Vortrag:
MALDI-TOF-MS-Subtyping zur Differenzierung von Mikroorganismen-Stämmen

Poster:
Listeria monocytogenes in einem Räucherfischbetrieb MALDI-TOF-MS als neues „Source-Tracking-Tool”

 

Danksagung:

Wir bedanken uns herzlich bei Frau Dr. Sylvia Kleta und ihrem Laborteam vom NRL für Listeria monocytogenes am BfR für die Durchführung der PFGE-Untersuchungen.

 

Bildnachweis

alle CVUA Freiburg

 

 

Bericht erschienen am 14.12.2017 14:48:06