Neue Methoden zur Identifizierung von Bierverderbern

Dr. Daniela Noack, Jannika Fuchs, Dr. Franziska Eisenbeiss, Dr. Jasmin Skuballa und Dr. Dirk Lachenmeier, CVUA Karlsruhe

 

Im Bier können Keime vorkommen, die – wenn sie in großer Menge vorliegen – zu erheblichen Geruchs- und Geschmackabweichungen führen („wie faulige Eier“). Routinemäßig werden diese bierschädlichen Keime mit speziell für dieses Getränk entwickelten Verfahren angezüchtet und die Keimzahl pro Milliliter Bier ermittelt. Zur Ermittlung und Beseitigung der Kontaminationsquellen im Betrieb sind reine Keimzahlangaben oft nicht ausreichend: Die Braumeister und die zuständige Behörde benötigen Informationen, mit welchen Bierverderbern sie es zu tun haben.

Das CVUA Karlsruhe hat zur Identifizierung von Bierkeimen über viele Jahre mit einer Methode gearbeitet, bei der im Bier vorhandene Bierverderber hochspezifisch mittels fluoreszenz-markierter Gensonden nachgewiesen werden (Noack et al. 2008). Die entstandenen Hybride werden anschließend unter dem Mikroskop betrachtet.

Leider birgt diese optische Methode einige Nachteile: Um ökonomisch zu arbeiten, müssen Proben gesammelt werden, bis sich eine Untersuchungsserie lohnt. Die Aufbereitung und mikroskopische Auswertung sind zeitaufwändig und erfordern hohen Sachverstand.
 

Lactobacillus brevis.
Abb.1: VIT-Test Lactobacillus brevis

 

Zwischen Probeneingang und Gutachtenausgang lag somit häufig ein beträchtliches Zeitintervall. Welche Alternativen boten sich an?

 

Aktuelle Techniken

Bei der MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation - Time Of Flight - Massenspektrometrie) werden Einzelkolonien von bewachsenen Nährmedienplatten entnommen und mit einem Laser beschossen. Bakterienproteine werden frei, die Moleküle werden ionisiert und anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Ein Ionendetektor wandelt die Ionen in ein elektrisches Signal um. Es entsteht ein Massenspektrum, das als charakteristischer „Fingerabdruck“ des Bakteriums mit einer Datenbank verglichen wird.

 

Mitarbeiterin des CVUA Karslruhe an Maldo-Tof 250k Gerät. 
Abb.2: Maldi-Tof 250k

 
Eine weitere Nachweistechnik stellt die 16S-Sequenzierung dar, mit der es möglich ist, bei Bakterien einen bestimmten Abschnitt der Erbinformation zu entschlüsseln. Dieser Abschnitt ist für jede Bakterienspezies charakteristisch und kann zur Identifizierung herangezogen werden. Mit Hilfe von Computerprogrammen wird nach der Sequenzierung eine Datenanalyse durchgeführt, bei der die ermittelte Gensequenz des zu identifizierenden Bakteriums mit bereits in öffentlichen Datenbanken (z.B. GenBank) hinterlegten 16S rRNA-Sequenzen verglichen wird. 

16S Elektropherogramm.

 Abb.3: 16S Elektropherogramm

 

Vorgehen

Zunächst musste sichergestellt werden, dass mit den verschiedenen Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt werden können. Dazu wurden zunächst zehn Isolate, die bereits mit Hilfe der fluoreszenz-markierten Gensonden als Lactobacillus brevis – Keime identifiziert worden waren, parallel mit MALDI-TOF-MS und 16S – Sequenzierung getestet. Alle drei Methoden führten zum selben Ergebnis. 

Infokasten

Lactobacillus brevis – Keime werden bei verdorbenem Bier am häufigsten identifiziert. Der Keim ist bestens an das „Milieu“ im Bier angepasst: Weder der niedrige pH-Wert, noch Alkohol und geringe Nährstoffgehalte machen ihm etwas aus. Sogar keimtötende Stoffe aus der Hopfenpflanze stören ihn nicht!

 

Daraufhin wurden noch weitere 22 Isolate verschiedener Lactobacillus-Spezies parallel mit MALDI-TOF-MS und 16S-Sequenzierung getestet. In 21 Fällen konnte ein übereinstimmendes Ergebnis erzielt werden.
Das Untersuchungsverfahren zum Nachweis von Lactobacillus brevis mittels MALDI-TOF-MS Technik wurde anschließend validiert, da speziell diesen Keimen erfahrungsgemäß in der Praxis die größte Bedeutung zukommt. 2015 wurde Lactobacillus brevis in 10 von 14 Bierproben mit hohen Keimzahlen an Bierverderbern gefunden.
Werden mit MALDI-TOF-MS andere Lactobacillus-Spezies nachgewiesen, kann die 16S-Sequenzierung zur Bestätigung und Identifizierung dienen.

Damit konnten wir die zeitaufwändige Gensonden-Methode in den verdienten Ruhestand verabschieden.


Literatur:
Melanie Pavlovic, Regina Konrad, Ingrid Huber und Ulrich Busch (2011):
Einsatz von MALDI-TOF-MS in der Lebensmittelanalytik, DLR Spezial März 2011
S.9-16

Noack, D., Knödl, C., & Lachenmeier, D. W. (2008): Evaluierung von fluoreszenz-markierten Gensonden und Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie als neue Methoden zur Bestimmung von bierverderbenden Bakterien. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 104(2), 65.

Clarridge, J. E. (2004): Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clinical microbiology reviews, 17(4), 840-862.

Sakamoto and Konings (2003): Beer spoilage bacteria and hop resistance, International Journal of Food Microbiology 89, p 105– 124

Barney, M., Volgyi, A., Navarro, A., & Ryder, D. (2001): Riboprinting and 16S rRNA gene sequencing for identification of brewery Pediococcus isolates. Applied and environmental microbiology, 67(2), 553-560.

 

 

Bericht erschienen am 17.10.2016 17:06:34